Neutrons, cristaux formés dans l'espace et enzymes

Un article récemment publié dans Cell Reports Physical Science révèle comment des chercheurs ont, pour la première fois, directement visualisé la position des atomes d'hydrogène dans les éléments fonctionnels clés d'une enzyme qui joue un rôle important dans le métabolisme de nombreux micro-organismes. Les mesures de diffraction nutroniques effectuées sur LADI III sur des cristaux de protéines perdeutérées produits dans des conditions de microgravité à la Station spatiale internationale (ISS) ont été les éléments clés de ce travail.

Contrairement aux rayons X, qui interagissent avec les électrons autour des noyaux, les neutrons interagissent directement avec les noyaux eux-mêmes.
Cela signifie que l'hydrogène (et son isotope plus lourd, le deutérium) diffuse les neutrons, ce qui en fait un outil idéal pour sonder la position des atomes d'hydrogène dans les macromolécules biologiques. Cependant, pour que la diffraction des neutrons fonctionne, il faut que les cristaux soient bien ordonnés et relativement grands. C'est là que la microgravité et l'ISS entrent en jeu.

Notre première "bouchée" est la « tryptophane synthase (TS) ». Il s'agit d'une protéine, une enzyme, qui accélère les réactions chimiques chez les organismes vivants. La TS est impliquée dans les processus métaboliques de nombreux micro-organismes différents, y compris des bactéries pathogènes telles que Salmonella enterica et Mycobacterium tuberculosis.

Passons maintenant à la deuxième bouchée : la TS est sous sa « forme aldimine interne ». Il y a pas mal de biochimie derrière ces trois mots, mais ce que nous devons en retenir est en fait simple. Certaines enzymes ont besoin de l'ajout d'une petite molécule, appelée cofacteur, pour fonctionner. Le cofacteur de la TS est le pyridoxal 5′-phosphate, ou PLP en abrégé. Le PLP est la forme active de la vitamine B6, présente dans pratiquement toutes les formes de vie et cruciale pour d'innombrables fonctions cellulaires. L'aldimine interne est tout simplement un complexe enzyme-PLP stable. Les enzymes dépendantes du PLP sont particulièrement intéressantes car elles forment une famille vaste et polyvalente, commune à de nombreux organismes. Cette famille comprend de nombreuses enzymes qui jouent un rôle dans les maladies humaines ou qui présentent un intérêt pour les applications d'ingénierie enzymatique. Malgré cet intérêt évident, des questions importantes demeurent quant au fonctionnement réel des enzymes dépendantes du PLP.

Et maintenant, notre troisième bouchée : les hydrogènes du site actif du complexe TS-PLP ont été révélés. Pour comprendre et modéliser la structure et le fonctionnement des enzymes, les scientifiques doivent les visualiser au niveau atomique. Environ la moitié des atomes des protéines sont des atomes d'hydrogène. Plus important encore, les atomes d'hydrogène des sites actifs (c'est-à-dire les parties de la molécule impliquées dans le fonctionnement de l'enzyme) sont réorganisés pendant la réaction. Comprendre où se trouvent les atomes d'hydrogène et comment ils se déplacent est donc essentiel pour comprendre le fonctionnement de l'enzyme.

Nous arrivons maintenant au plus gros morceau de tous : la « diffraction neutronique ». Les rayons X et les neutrons nous permettent tous deux de regarder à l'intérieur des cristaux, et leurs pouvoirs sont souvent complémentaires. Les rayons X interagissent avec la densité électronique autour des atomes, ce qui signifie qu'en diffraction des rayons X, les positions des atomes d'hydrogène fonctionnels clés (avec un seul électron) restent indéterminées. Les neutrons, en revanche, interagissent avec les noyaux atomiques, ce qui veut dire que l'hydrogène (et son isotope plus lourd, le deutérium) diffusent les neutrons aussi bien que les noyaux plus lourds. Les neutrons sont donc idéaux pour sonder l'emplacement des atomes d'hydrogène dans les macromolécules biologiques. Avec les neutrons, cependant, le défi est de disposer de cristaux grands et bien ordonnés. D'où l'utilisation d'un cristal cultivé en microgravité.

Les données de diffraction neutronique ont été collectées sur l'instrument LADI-III de l'ILL, un diffractomètre de Laue dédié à la recherche en biologie à haute résolution (1,5 - 2,5 Å). LADI-III utilise un grand détecteur de surface cylindrique composé de plaques image sensibles aux neutrons, qui entourent complètement le cristal et permettent d'enregistrer simultanément un grand nombre de taches de diffraction. Une gamme de longueurs d'onde neutroniques de 2,85 à 3,80 Å a été utilisée pour la collecte des données, avec quatre orientations cristallines différentes échantillonnées et un total de 57 images collectées. Le principe est le suivant : le faisceau de neutrons est diffracté par les noyaux atomiques à l'intérieur du cristal, produisant un motif de taches de diffraction. Comme il existe une relation spécifique entre le motif de diffraction 2D et la structure 3D à l'intérieur du cristal, les scientifiques peuvent utiliser les informations de ces motifs pour déterminer la structure 3D, y compris les très importants atomes d'hydrogène.

Afin de faciliter la localisation des atomes d'hydrogène individuels, la protéine a été produite en utilisant une technique appelée perdeutération : tous les atomes d'hydrogène de la molécule ont été remplacés par du deutérium pour les rendre plus visibles. L'ILL offre à sa communauté d'utilisateurs et à ses chercheurs internes non seulement des instruments de haute performance, mais aussi des plateformes et des laboratoires hautement spécialisés pour préparer et caractériser les échantillons avant, pendant et après les expériences neutroniques, certains d'entre eux dans le cadre de partenariats avec des instituts voisins. En particulier, le Laboratoire de Deutération de l'ILL (D-Lab) peut produire une variété de molécules biologiques partiellement ou entièrement deutérées (perdeutérées), y compris des protéines.

Et c'était la dernière partie du titre ! «La diffraction neutronique d'un cristal cultivé en microgravité révèle les hydrogènes du site actif de la forme aldimine interne de la tryptophane synthase"  est maintenant, espérons-le, beaucoup plus facile à déchiffrer après l'avoir examiné morceau par morceau, en petites bouchées. Ce qui ressort, c'est l'importance de comprendre le fonctionnement des enzymes impliquées dans la propagation des infections et le rôle central des données de diffraction neutronique dans cette recherche.